Электронно-микроскопическое исследование влияния тиосульфата натрия на ультраструктурные преобразования митохондрий печени крыс, интоксицированных карбон тетрахлоридом

Ключевые слова: митохондрии печени крыс, интоксикация, CCL4- тиосульфат натрия, электронная микроскопия, регенерация

Печень представляет собой центральный орган химического гомеостаза, где создается единый обменный и энергетический пул для метаболизма белков, жиров и углеводов. Нарушение этого равновесия на любом уровне организации приводит к неблагоприятному эффекту или токсичности [14]. На сегодняшний день одной из актуальных проблем остаются токсические поражения печени, вызванные различными химическими веществами, применяемыми в промышленности, сельском хозяйстве и быту, а также природными гепатотропными ядами. При воздействии большинства гепатотоксичных веществ непосредственно повреждается паренхима печени и нарушаются обменные ферментативные процессы в ее ткани. Острые органофосфатные отравления являются причиной серьезных гистопатологических эффектов в печени крыс, однако эти изменения обратимы при соответственных мерах лечения [9]. К одной из основных функций печени относится  детоксицирующая функция. Реакции детоксикации осуществляются с помощью ферментов, связанных с гладкой эндоплазматической сетью и митохондриями (Мх). Исследование криосекции ткани крысы методом флюоресцентной микроскопии, показало, что после введения препарата последний аккумулируется в Мх [5]. 

Целью данной работы было исследование влияния антиоксидантного фактора (тиосульфата натрия) на ультраструктурные преобразования Мх печени крыс, интоксицированных CCL₄.

Материал и методы

Материалом для данной работы послужила печень крыс линии Vistar. Белые половозрелые крысы-самцы (массой 180-200 г) были разделены на 3 группы  (по 3 животных в каждой): I–интактная; II– интоксицированная карбон тетрахлоридом (CCL₄); III– интоксицированная CCL₄ + тиосульфат натрия (Na₂S₂O₃). II группа получала внутрибрюшинно инъекцию 0, 3 мл CCL₄ дважды в течениe эксперимента (на 1-й и 8-й дни). III  группа получала внутрибрюшинно  инъекцию 0,3 мл CCL₄ также дважды (на 1-й и 8-й дни) плюс  к этому по 1,5 мл Na₂S₂O₃ на 4, 9, 25-й дни эксперимента. По окончании опыта животные были декапитированы под легким эфирным наркозом. Образцы ткани печени, взятые сразу после декапитации, были помещены сперва в холодный парафармальдегид-глютаральдегидный фиксатор, затем в четырехокись осмия (OsO₄). Дальнейшая обработка материала была осуществлена по традиционной методике, принятой в трансмиссионной электронной микроскопии: обезвоживание в восходящем ряду спиртов и ацетона, с последующим заключением в эпоксидные смолы. Резка препарата осуществлялась на ультратоме “Райхерт”. Полученные ультратонкие срезы были контрастированы уранил ацетатом и цитратом свинца, после чего были просмотрены под электронным микроскопом фирмы “TESLA”.

Результаты и обсуждение

Результаты наших исследований отображены на рис. 1–3. Как показало наше исследование, Мх печени крыс, интоксицированных CCL4, претерпевают значительные структурные изменения. Теряется присущее нормальным органеллам пространственное расположение, имеет место практически полная редукция шероховатого эндоплазматического ретикулума (ШЭР). Наблюдается конденсация органелл вблизи ядра (Яд) с частичным слипанием последних с нуклеолеммой и в ряде случаев с плазматической мембраной гепатоцитов, при этом Мх имеют электронноплотный матрикс, конфигурация крист либо неясна, либо же представлена в форме пчелиных сот. Судя по всему, такое пространственное расположение Мх приводит к упадку функциональной активности последних (рис.1).

 Рис.1. Процесс слипания Мх с: a–плазмолеммой и b–нуклеолеммой гепатоцитов, x 18000 

Однако наиболее характерные структурные реорганизации Мх можно разделить на 3 основных типа: 1– гигантские Мх, пути формирования которых до сих пор остаются в центре внимания многих исследователей. Одни авторы полагают, что подобные мегамитохондрии (ММ) образуются путем слияния маленьких органелл [3,10,11]; другие – набуханием собственно органелл [7]; 2–сгруппированные, но не склеившиеся органеллы; 3–бесформенные  массы (БсМ), лишенные какой-либо структурности. В процентном соотношении это можно представить следующим образом: около 30% всей популяции Мх гепатоцитов приходится на гигантские Мх, 20%–на сгруппированные органеллы и 50%– на образование бесформенных масс (рис.2). Гигантские Мх имеют низкий внутренний мембранный потенциал и не сливаются друг с другом или с нормальными Мх. Дисфункциональные гигантские Мх не могут восстановить свою структуру путем слияния или обмена своим содержимым с полноценно функционирующими Мх [8]. Потребление О2 и способность синтеза ATФ набухшими ММ также наглядно снижается [12]. Сгруппировывание органелл представляет собой ответную реакцию на повышенную потребность энергии клеткой, поскольку Мх являются достаточно динамичными органеллами, и в основном концентрируются в тех частях клетки, где есть повышенная необходимость в энергии.                                                              

 Рис.2. Структурные преобразования Мх  печени крыс при интоксикации CCL₄: a–формирование гигантских Мх;  b, c–образование бесформенных масс; d–сгруппировывание Мх, x 10000

Если перечисленный выше процесс склеивания и разъединения Мх представляет собой динамичный процесс, то образование бесформенных масс несет необратимый характер. Можно предположить, что подобные массы выпадают из энергообеспечивающей функции клеток, приводя к резкому снижению всех энергозависимых процессов, происходящих в клетках.

Необходимо отметить, что вызванное различными экспериментальными условиями формирование ММ успешно подавляется “сборщиками” свободных радикалов, такими как альфа-токоферол и т.д. [2].

Как показало наше исследование, под воздействием тиосульфата натрия (синергиста альфа-токоферола) на фоне интоксикации CCL4 картина наблюдений резко отличается от таковой в первом случае. ШЭР представлен отдельными расширенными трубочками, располагается между органеллами. Иногда наблюдаются целостные сети ШЭР, однако Мх, оплетенные ШЭР, встречаются крайне редко. Необходимо отметить, что Мх здесь также претерпевают структурные изменения, которые сильно отличаются от таковых при интоксикации CCL4. Воздействие тиосульфата натрия оказывает позитивное влияние на структурные преобразования Мх, препятствует формированию бесформенных масс и мегамитохондрий. Однако все еще встречаются Мх, имеющие набухший матрикс, при этом последние обычно расположены

 Рис. 3. Ультраструктура Мх печени крыс после введения тиосульфата натрия на фоне интоксикации CCL₄: а–одиночные Мх с остатками ШЭР между ними; b–Мх с набухшим матриксом, оплетенные расширенными трубочками ШЭР, 

x 25000; c–сгруппированные Мх;  d–гиперплазия Мх, маленьких по размерам, x 18000

группами. Параллельно с этим тиосульфат натрия способствует гиперплазии. Наблюдается большое количество малых по размерам Мх, при этом ШЭР между ними практически не встречается (рис. 3).

Образование маленьких по размерам Мх несет, по-видимому, приспособительный характер в ответ на стресс, вызванный интоксикацией. Подобные колебания форм Мх тесно связаны с их функциональной активностью, так как известно, что именно маленьких размеров Мх обладают наибольшей активностью [1]. Таким образом, вполне допустимо, что тиосульфат натрия способствует образованию de novo новых, молодых митохондрий.        

Известно, что Мх являются метаболическими органеллами, служащими в качестве “силовых установок клеток“ [13]. Поэтому любые изменения ультраструктуры последних могут оказать негативный эффект на энергозависимые метаболические процессы, происходящие в клетках. В нормальных условиях Мх меняют свою форму динамично в основном через разъединение и слипание[6] в ответ на множество сигналов [4]. Однако  если действие данных негативных сигналов несет более длительный характер, то изменения в морфологии Мх могут нести необратимый характер (образование бесформенных масс), что в свою очередь может привести к энергодефициту в клетках. Кроме того, подобные изменения в морфологии Мх, сопровождаясь рядом нарушений в обменных процессах, могут явиться непосредственной причиной апоптоза. Известно, что препараты, вводимые в организм, накапливаются прежде всего в Мх[5], таким образом последние  могут служить также и первичным маркером при определении эффективности воздействия того или иного препарата, используемого при лечении различных заболеваний. 

Как показало наше исследование, введение тиосульфата натрия, обладающего антиоксидантным и мембраностабилизирующим эффектами, на фоне интоксикации CCL4, поддерживает нормальную динамику в морфологии Мх, препятствуя необратимым изменениям в ультраструктуре последних и, соответственно, апоптозу гепатоцитов. 

Таким образом, тиосульфат натрия может защитить печень от CCL4 индуцированной интоксикации, препятствуя структурной реорганизации Мх и способствуя репаративной регенерации.

Литература

1. Гусакова Н.Ф.  Автореф. дис. ...  докт. биол. наук. М., 1988.
2. Antosiewicz J., Nishizawa Y., Liu X., Usukura J., Wakabayashi T. Suppression of the hydrazine-induced formation of megamitochondria in the rat liver by alpha-tocopherol, Exp. Mol. Pathol., 1994 Jun; 60(3): 173-87.
3. Bakeeva L.E., Manteifel’ V.M., Rodichev E.B., Karu T.I. Formation of gigantic mitochondria in human blood lymphocytes under the effect of an He-Ne laser, Mol. Biol. (Mosk), 1993 May-Jun; 27(3): 608-17.
4. Cerveny K.L., Tamura Y., Zhang Z., Jensen R.E., Sesaki H. Regulation of mitochondrial fusion and division, Trends Cell. Biol., 2007 Nov; 17(11): 563-9.
5. Fellous R., Coulaud D., el Abed I., Roques B.P., Le Pecq J.B., Delain E., Gouvette A. Cytoplasmic accumulation of ditercalinium in rat hepatocytes and induction of mitochondrial damage, Cancer Res., 1988 Nov 15; 48(22): 6542-9. 
6. Huang P., Yu T., Yoon Y. Mitochondrial clustering induced by overexpression of the mitochondrial fusion protein Mfn2 causes mitochondrial dysfunction and cell death, Eur. J. Cell. Biol., 2007 Jun; 86(6): 289-302.
7. Knabe W., Kuhn H.J. Morphogenesis of megamitochondria in the retinal cone inner segments of Tupaia belangeri (Scandentia), Cell Tissue Res., 1996 Jul; 285(1):1-9
8. Navratil M., Terman A., Arriaga E.A.  Giant mitochondria do not fuse and exchange their contents with normal mitochondria, Exp. Cell. Res., 2008 Jan 1; 314(1): 164-72.
9. Satar S., Satar D., Tap O., Koseoglu Z., Kaya M. Ultrastructural changes in rat liver treated with pralidoxime following acute organophosphate poisoning, Mt. Sinai J. Med., 2004 Nov; 71(6): 405-410.
10. Tandler B., Dunlap M., Hoppel C.L., Hassan M. Giant mitochondria in a cardiomyopathic heart, Ultrastruct. Pathol., 2002 May-Jun; 26(3): 177-83.
11. Wakabayashi T., Horiuchi M., Sakaguchi M., Misawa K., et al. Mechanism of hepatic megamitochondria formation by ammonia derivatives. Correlation between structure of chemicals and their ability to induce the formation of megamitochondria, Eur J. Biochem., 1984 Sep 3: 143(2): 455-65.
12. Wakabayashi T.  Structural changes of mitochondria related to apoptosis: swelling and megamitochondria formation, Acta Biochim. Pol., 1999; 46(2): 223-37.
13. Wei Y., Rector R.S., Thyfault J.P., Ibdah J.A. Nonalcoholic fatty liver disease and mitochondrial dysfunction, World J. Gastroenterol., 2008 Jan 14; 14(2): 193-9.
14. Williams G.M., Iatropoulos M.J. Alteration of liver cell function and proliferation: differentiation between adaptation and toxicity, Toxicol. Pathol., 2002 Jan-Feb; 30(1): 41-53.

Вопросы, ответы, комментарии