Исследование некоторых территорий Армении на наличие природных очагов клещевого энцефалита и лихорадки Западного Нила

Ключевые слова: клещевой энцефалит, лихорадка Западного Нила, комары,  мошки,полимеразная цепная реакция

Арбовирусные инфекции в связи с их полиэтиологичностью, широкой распространенностью, тенденцией к возникновению новых нозоформ находятся в центре внимания исследователей во всем мире. Арбовирусы, или вирусы с трансмиссивной передачей восприимчивым позвоночным кровососущими членистоногими переносчиками, – это группа вирусов, которым свойственна природная очаговость, циркуляция в природе вне зависимости от человека. Человек в подавляющем большинстве случаев включается в экологическую цепь арбовирусов случайно, при стечении определенных условий: изменении экологических условий, регулирующих взаимосвязь вируса, переносчика и хозяина-позвоночного. В настоящее время описано около 500 арбовирусов, из которых патогенными для чело-века являются около 100. Арбовирусы являются сочленами природных биоценозов и их экология неразрывно связана с экологией позвоночных животных и кровососущих членистоногих, служащих индикаторами функционирования вирусов в естественных условиях. Изучение различных аспектов проблемы арбовирусных инфекций приобретает особое значение в регионах с благоприятными для циркуляции арбовирусов климатичес-кими условиями, обилием и разнообразием видов членистоногих переносчиков и их теплокровных прокормителей [9,11,13,14]. Клещевой энцефалит (КЭ) и лихорадка Западного Нила (ЛЗН) относятся к природно-очаговым вирусным инфекциям, возбудителями которых являются РНК- содержащие вирусы – вирус КЭ (ВКЭ) и вирус ЛЗН (ВЛЗН), относящиеся к семейству Togaviridae. Природные очаги КЭ и ЛЗН распространены в различных климато-географических зонах [4-8,10,12]. Проблема арбовирусных инфекций актуальна и для Армении с её своеобразным ланд-шафтом и климатом, миграцией населения и сельскохозяйственных животных, способствующей смещению и переносу кровососущих членистоногих, потенциальных сохранителей и переносчиков арбовирусов из одной природно-климатической зоны в другую. Согласно данным ранее проведенных на территории Армении исследований, показано наличие в различных климато-географических поясах республики соответствующих видов кровососущих переносчиков арбовирусов,а также из пулов членистоногих выделены штаммы представителей арбовирусов, в том числе ВКЭ и ВЛЗН [1-3] . 

Целью настоящей работы явилось проведение пилотного молекулярно-генетического исследования РНК, выделенной из комаров и мошек, обитающих на предположительно неблагоприятных по КЭ и ЛЗН территориях Армении. 

 Материал и методы 

В качестве исследуемого материала был использован полевой материал – комары и мошки, собранные в период с апреля по октябрь 2010, 2011гг. (период биологической активности членистоногих переносчиков) во время экспедиционных выездов. Местом сбора служили различные территории следующих марзов Армении: Арарат, Армавир, Арагацотн, Лори, Вайоц дзор, Сюник, Тавуш. Отлов комаров проводили эксгаустером или пробирками в местах их дневок из разных типов помещений (хлева, навесы, подвалы, курятники, жилые помещения, балконы, чердаки и др.). После энтомологической идентификации собранных комаров и мошек группировали в отдельные пулы в соответствии с местом сбора для последующего молекулярно-генетического исследования. За пе-риод исследования было собрано 32 пулa из разных территорий вышеуказанных марзов Армении.

Молекулярно-генетическое исследование собранного материала проводили с помощью обратной транскрипции с последующей полимераз-ной цепной реакцией (ПЦР).

Экстракция РНК, синтез кДНК. РНК из полевого материала (комары и мошки) экстрагировали с помощью RNeasy Mini Kit (QIAGEN, Германия), в соответствии с инструкцией изготовителя. Первоначально полевой материал гомогенизировали в ступке, затем добавляли лизирующий буфер и с помощью шприца несколько раз проводили через иглу (0,9мм) для получения однородного гомогената. Суспензию центрифугировали (3 мин, 10000g), отделяли супернатант и добавляли 70% этанол в равном объеме, перемешивали и наносили на колонку, связывающую РНК. Колонку со связанной РНК несколько раз промывали буферами для максимального освобождения от примесей (ДНК, белки, соли). РНК с колонки эллюировали 2 раза с использованием 30 мкл эллюата на каждую порцию. Количество и чистоту экстрагированной РНК определяли спектрофотометрически при 260/280 нм. 

Реакционную смесь Мастер Микс для обратной транскрипции и синтеза кДНК готовили в объеме 25 мкл и проводили с помощью набора реагентов для обратной транскрипции One Step RT-PCR Kit (QIAGEN, Германия) в соответствии с рекомендациями производителя в следующей пропорции: 16 мкл (RNase free water), 5 мкл 5 x QIAGEN One Step RT-PCR buffer, 1 мкл смеси dNTP (содержащей 10 мМ каждого нуклеотида), 1 мкл QIAGEN One Step RT-PCR Enzyme Mix и 2 мкл (~5 нг) образца РНК. Синтез кДНК проводился при следующем режиме: обратная транскрипция – 30 мин, 50⁰C, инактивация – 15 мин, 95⁰C. Синтезированную кДНК хранили при 40C до последующего использования.

Полимеразная цепная реакция. Амплификацию проводили с использованием набора для определения вирусов КЭ и ЛЗН производства Изоген, Россия, в соответствии с инструкцией производителя. В ПЦР Мастер Микс добавляли по 10 мкл образцов полученной кДНК, к положительно контрольному образцу добавляли 10 мкл положительного контроля, а в отрицательный – 10 мкл воды. Режим амплификации фрагментов ДНК проводили в течение 45 циклов и при условиях, рекомендованных произ-водителем. Ампликоны разделяли методом электрофореза в 2 % агарозном геле (Sigma, США) в ТАЕ буфере с бромидом этидия.

Результаты и обсуждение

При морфологическом изучении полевого материала было установлено, что собранные комары являются представителями рода Anopheles, а мошки относятся к роду Simulium.

В молекулярно-генетическом исследовании были проанализированы 32 образца полевого материала (пулы собранных переносчиков) на наличие РНК вирусов КЭ и ЛЗН в трех сериях экспериментов (а, б, в). На рис. 1 и 2 отображены результаты ПЦР анализа полевого материала на наличие ВКЭ и ВЛЗН соответственно. Положительный РНК фрагмент ВКЭ – верхняя линия первой дорожки с положительным контролем (рис.1). Нижняя линия – положительный контроль реакции ПЦР. Положительный РНК фрагмент ВЛЗН – верхняя линия первой дорожки с положительным контролем (рис. 2). Нижняя линия – положительный контроль реакции ПЦР. 

 Рис. 1. Электрофоретическая детекция продуктов амплификации полевого материала на наличие фрагментов РНК ВКЭ. Дорожки (слева направо во всех сериях): 1–положительный контроль, 2–отрицательный контроль, далее–иссследуемые образцы

Рис. 2. Электрофоретическая детекция продуктов амплификации полевого материала на наличие фрагментов РНК ВЛЗН. Дорожки (слева направо во всех сериях): 1–положительный контроль, 2–отрицательный контроль, далее–иссследуемые образцы

Как видно из рис. 1 (а, б, в) и 2 (а,б,в), в исследуемых образцах не обнаружены фрагменты РНК ВКЭ и ВЛЗН,что свидетельствует об отсутст-вии данных вирусов в полевом материале, собранном в Араратском, Армавирском, Арагацотнском, Лорийском, Вайоцдзорском, Сюникском, Тавушском марзах. Полученные данные не доказывают, но и не отрицают, наличия в настоящее время природных очагов КЭ и ЛЗН в Армении, так как ранее из комаров и клещей, собранных в различных климато-географических зонах, в том числе и на указанных территориях, были изолированы штаммы вирусов КЭ и ЛЗН. Это предопределяет необходимость продолжения исследований. 

Работа финансировалась грантом А-1662 Международного научно-технического центра МНТЦ.

Литература

1. Алексанян Ю.Т., Оганесян А.С., Шахназарян С.А., Манукян Д.В. Выявление природных очагов возбудителей арбовирусных инфекций в различных климато-географических поясах Армении. Сб. научных трудов “Медицинская география Армении”, Ереван, 2005, с.23-24.
2. Манукян Д.В. , Оганесян А.С., Шахназарян С.А., Алексанян Ю.Т. Роль комаров в передаче арбовирусов в Армении.Ж. Медицинская паразитология и паразитарные болезни, 2006,  2, с. 38-39.
3. Оганесян А.С., Алексанян Ю.Т., Шахназарян С.А., Манукян Д.В. Эпидемиология арбовирусных инфекций в Армении. Ж. Эпидемиология и инфекционные болезни, 2006,  2, с. 22-24.
4. Онищенко Г.Г., Липницкий А.В., Алексеев В.В., Антонов В.А., Крючкова Т.П., Крутоголовова Т.А. Эпидемиологическая ситуация по лихорадке Западного Нила в России в 2010г. Ж.Микробиологии, эпидемиологии, иммунобиологии, 2011, 32, с. 115-120.
5. Cerutti F., Giacobini M., Mosca A., Grasso I.,Rambozzi L., Rossi L. Evidence of mosquito-transmitted flavivirus circulation in Piedmont, North-Western Italy. Parasit.Vectors, 2012, 22; 5, p.99.
6. Colpitts T.M., Conway M.J., Montgomery R.R., Fikrig E. West Nile virus:biology, transmission and human infection. Clin. Microbiol. Rev., 2012; 25(4), p.635-648.
7. Dobler G., Gniel D., Petermann R., Pfeffer M. Epidemiology and distribution of tick-borne encephalitis. Wien Med. Wochenschr., 2012; 162(11-12), p. 230-238.
8. Holidge B.S., Gonzalez-Scarano F., Soldan S.S. Arboviral encephalitides: transmission, emergence and pathogenesis. J.Neuroimmune Pharmacol., 2010; 5(3), p. 428-442.
9. Hubalek Z., Rudolf I. Tick-borne viruses in Europe. Parasitol. Res., 2012; 111(1), p. 9-36.
10. Kalaycioglu H.,Korukluoglu G., Ozkui A. et al. Emergence of West Nile virus infections in humans in Turkey,2010 to 2011. Euro Surveil.,2012; 24,17,p. 21.
11. Lasala P.R., Holbrook M. Tick-borne flaviviruse. Clin.Lab.Med.,2010;30(1),p.221-235.
12. Perez R.M., Games S.S., Clavero M.A. West Nile virus infection. Enferm. infect. Microbiol. Clin., 2011; 29 Suppl. 5, p. 21-26.
13. Tutle L., Griffiths M.J., Solomon T. Encephalitis caused by flaviviruses. QJM, 2012; 105(3), p. 219-223.
14. Ulbert S. West Nile virus: the complex biology of an emerging pathogen. Intervirology, 2011; 54(4), p. 171-184.

Вопросы, ответы, комментарии