Повышение уровня экстрацеллюлярной nadph оксидазы в асцитной карциноме легких человека

Молекулярно-биохимические механизмы зло-качественного новообразования легких еще окончательно не определены [1]. Контролируемое продуцирование О₂^- NADPH  оксидазами в нефагоцитирующих клетках играет определенную роль в процессе регуляции функции клеток (включая опухолевые клетки). В частности, А545 культуры клеток легких человека секретируются NADPH  оксидазами, а продуцирование О₂^- этими ферментами подавляется дифенилениодониумом (ингибитором NADPH  оксидаз) [2]. При канцерогенезе легких у курящих людей увеличены активности NADPH оксидаз в культуре опухолевых клеток, по сравнению с нормальными (неопухолевыми) клетками. При этом снижена активность миелопероксидазы и повышен уровень Г8И в опухолевых клетках [3]. NADPH  оксидаза регулирует дифференциацию и пролиферацию нормальных и опухолевых клеток тканей, включая клетки легких, участвует в процессе восстановления поврежденных участков стволовыми клетками [4]. NADPH  оксидаза регулирует ангиогенез тканей и развитие опухолевых клеток легких, в которых обнаружены высокие дозы О₂^- и перекиси водорода [5]. Активные формы кислорода (АФК) включены в процессе антиопухолевого действия лекарств, как цититоксиче- ские агенты. В результате инкубирования (15 мин) опухолевых клеток легких А₅₄₅ с препаратом па- клитакселом (ПТ) наблюдается концентрационнозависимое увеличение уровня внутриклеточных АФК. Добавленный К-ацетоцистеин или Г8И (скавенджеры перекиси водорода), индуцирует 4-разовое снижение токсического эффекта ПТ [6]. Аденокарцинома легких является эпителиальной опухолью жидкости в полостях тела, в которых наблюдается секреция транскрипционного фактора щитовидной железы (ТФ-1). Этим и отличается аденокарцинома легких от карцином, локализованных в других органах [7,8]. При этом препараты гефитиниб и SYUNS 7 (2,11-бис(фенилсулфанил)-6- изогексенилнафтазарин) являются эффективными ингибиторами образования брюшинной водянки (асцита) и злокачественного новообразования [9,10]. К настоящему времени нет данных о наличии экстрацеллюлярной NADPH  оксидазы при обострении асцитной карциномы легких человека. Выделение этой NADPH  оксидазы из асцитной ксрциномы легких человека и определение оптическими спектральными методами активности этого фермента являлось целью работы.

Материал и методы. Жидкость асцитной карциномы легких человека (шесть больных, 61-74 лет),с давностью заболевания 2,5-3г была доставлена из онкологического диспансера г. Гюмри.

Выделение фракции экстрацеллюлярной NADPH  оксидазы (или цитохрома b₅₅₈) из жидкости асцитной карциномы легких (АКЛ). Фракции экстрацеллюлярной NADPH  оксидаз [ЭНО] из АКЛ и сыворотки донорской крови человека были получены методом, разработанным нами [11]. Следы эритроцитов и плазменных клеток из жидкости АКЛ и из сыворотки донорской крови (СДК) были удалены путем их центрифугирования при 14000об/мин, 15мин. Супернатанты (цвет слаборозовый) инкубировали в аэробных условиях в течение 4 суток при 4^о. Далее, после их центрифугирования, в приведенных условиях и разбавления водой (5-6 раз) фракции экстрацеллюлярной КАБРИ оксидазы из АКЛ и СДК выделяли ионобменной хроматографией надосадочно- го раствора на сефадексе ДЕАЕ А-50 с элюированием 0,04М КФБ. После вторичного разбавления элюата водой (20 раз) и ионобменного хроматографирования на колонке с целлюлозой ДЕ-52, фракцию экстрацеллюлярной NADPH  оксидазы из АКЛ или из СДК элюировали 0,04М КФБ.

Определение NADPH  зависимой О₂^- продуцирующей активности изоформ экстрацеллюлярной NADPH  оксидаз из АКЛ и СДК. NADPH зависимую О₂^-продуцирующую активность изоформ экстрацеллюлярной КАБРИ оксидазы [12] определяли нитротетразолиевым синим (НТС) методом, путем вычисления процента образующегося формазана при 560нм в результате восстановления НТС супероксид- ными радикалами. За единицу NADPH  зависимой О₂^- продуцирующей активности изоформ NADPH  оксидазы принимали количество белка (плотность оптического поглощения Р-полосы при 530нм), которое стимулирует образование формазана на 50%. Удельная КАБРИ зависимая О₂^- продуцирующая активность была определена в расчете на 1мл эритроцитов, 1мл сыворотки или 1г тканей.

Определение ферриИb-восстанавливающей активности изоформ экстрацеллюлярной NADPH  оксидаз из АКЛ и СДК. ФерриНЬ-восстанавливающую активность [13] изоформ экстрацеллюлярной NADPH оксидаз из АКЛ и СДК определяли используя свежеполученный ферриНЬ цитоплазмы эритроцитов человека величиной плотности оптического поглощения (а полоса поглощения) при А₅₆₅=0 ,6 оптических единиц. Непосредственно в кварцевых кюветах спектрофотометра, к 3мл раствора ферриНЬ добавляли 0,2мл NADPH  оксидаы с А₅₃₀=0,2 оптических единиц. После перемешивания реакционной смеси проводили инкубацию в аэробных условиях в течение 15-16ч при 30^о. Далее, после повторного перемешивания реакционной смеси определяли кинетику восстановления ферриНЬ до ферроНb, путем измерения снижения плотности а полосы поглощения ферри Нb при 565нм (это снижение прямо пропорционально образующемуся ферроНb при А₅₅₅). За единицу ферриНb-восстанавливающей активности NADPH  оксидазы принимали количество белка, вызывающего снижение плотности максимального оптического поглощения а-полосы ферриНb величиной до 0,05 оптических единиц в течение часа при 20^о. Удельная ферриНb-восстанавливающая активность изоформы NADPH оксидазы была определена в расчете на 1мл жидкости АКЛ или 1мл СДК. Оптические спектральные измерения осуществляли на спектрофотометре “Specord UV/VIS” (Германия), длиной оптического пути 1см. Статистическую обработку полученных результатов осуществляли об-щеизвестным методом вариационной статистики Стьюдента-Фишера с определением критерия достоверности «р».

Результаты и обсуждение

С использованием ионобменной хроматографии на целлюлозе ДЕ-52 и сефадексе ДЕАЕ А-50 впервые выделена фракция экстрацеллюлярной КЛБРН оксидазы (ЭНО) из асцитной карциномы легких человека (АКЛ), которая имеет характерные для NADPH оксидаз оптические спектральные показатели (рис.1).

Рис. 1. Оптические спектры поглощения экстрацеллюлярной NADPH оксидазы: из асцитной карциномы легких человека (1), из сыворотки донорской крови человека (2), (3) - после разбавления КФБ первого или второго в окисленном состоянии, (4) - после восстановления третьего дитионитом натрия

Наряду с максимумами оптического поглощения в окисленном состоянии: при 560, 530, 412нм (имеется и характерное для ЭНО сыворотки донорской крови оптическое поглощение при 485 нм) и в восстановленном состоянии: при 558, 525 и 418нм. По форме оптических спектров ЭНО из АКЛ не отличается от ЭНО из СДК. Однако, удельное содержание ЭНО из АКЛ (плотность максимального оптического поглощения β-полосы при 530нм) выше таковой у ЭНО из СДК на 60,1±7,3% (р‹0,05). Наряду с этими данными, NADPH зависимая О₂^- -продуцирующая активность ЭНО из АКЛ практически ближе таковой (увеличена всего на 8,3±1,1% (р‹0,03) у ЭНО из СДК (рис.2). С другой стороны, ферригемоглобин (ферриНb)-восстанавливающая активность ЭНО из АКЛ ниже таковой у ЭНО из СДК на 21,5±4,4 % (р‹0,05). Снижение ферриНb-восстанавливающей активности у ЭНО из АКЛ свидетельствует об определенном ослаблении кислородного гомеостаза в АКЛ (ферриНb или метНb не способны перенести молекулярный кислород к клеткам [14]). При этом факт слабого покраснения жидкостной среды карциномы легких свидетельствует о том, что при накоплении этой жидкости в легких происходит ослабление эритроцитов.

Рис. 2. NADPH зависимая О₂^- продуцирующая и ферри- гемоглобин-восстанавливающая активности NADPH оксидаз. а — NADPH зависимая О₂^- продуцирующая активность NADPH оксидазы из сыворотки донорской крови человека (1), из жидкости карциномы легких человека (2), б — ферриИb— восстанавливающая активность NADPH оксидаз: из сыворотки донорской крови человека (1), и из жидкости карциномы легких человека (2).

Механизм формирования ЭНО пока не определен, однако это имеет место при таких патологических состояниях, когда имеет место снижение стабильности эритроцитов в результате перекисного окисления ненасыщенных жирных кислот эритроцитарных мембран (лимфобластический и миелобла- стический лейкозы [15], саркома-45 [16], интоксикация тяжелыми металлами [17], сердечно-сосудистые заболевания [18]). Фактически для роста АКЛ определенную роль имеет не только интрацеллюларные [19], но и экстрацеллюлярные О₂^-, продуцируемые ЭНО в жидкостной среде, в которой находятся клетки карциномы легких человека. По предварительным результатам ЭНО формируется и в асцитной карциноме Эрлиха у мышей, и ее содержание увеличивается также со снижением стабильности эритроцитов. При этом удельное содержание ЭНО из асцитной карциномы Эрлиха выше таковой у ЭНО из АКЛ около 5 раз.

Из вышеуказанного следует, что при АКЛ человека для развития карциномы определенную роль имеет и экстрацеллюлярная О₂^- продуцируемого ЭНО. Возможно, введением в жидкостной среде карциномы антиоксидантов (для снижения от необходимого уровня О₂^-) или, наоборот, прооксидантов (супрол [20]), для увеличения от необходимого уровня О₂^- можно подавлять рост АКЛ, так как и снижение, и увеличение от физиологически необходимого уровня О₂^- вызывает нарушение окислительно-восстановительного статуса опухолевых клеток и их гибель [21].

Список литературы

1. Lemjabbar-Alaou H., Sidhu S.S., Mengistab A., Gallup M. PloS One, 2011, 6(3): e17.
2. Kolarova H., Bino' L., Pejchalova' K., Kubala L. Folia Biol (Praha), 2010, 56(5), 211-217.
3. Ilonen I.K., Basanen J.V., Sihvo E.I., Knutti.a A. et al. Acta Oncol., 2009, 48(7): 1054-1056.
4. Chan E.C., Jiang F., Pashavariya H.M., Dusting G.L. Pharmacol.Ther., 2009, 122(2): 97-108.
5. Ushio-fukai M., Nakamura Y. Cancer.Lett., 2008, 266(1):37-52.
6. Alexander J., Batteox F., Nicco C., Che'reau C. et al. Int.J. Cancer, 2006, 119(1): 41-48.
7. Gamez-Fernandez C., Jorga M., Delgado P.I., Gangei- Azar P. Cancer, 2002, 96(5): 289-293.
8. Kim J.H. Choi Y.D., Lee I.S., Lee J.H., Nam J.H., Choi C. Acta Cytol., 2010, 54(3): 277-282.
9. Nakata H., Tiji T., Ohsaki Y. Gan To Kagaku Ryoho, 2004, 31(1):87-89.
10. Huang H., Xie B.F., Zhu X.F., Fong G.K., et al. Ai Zheng., 2005, 24(12): 1453-1458.
11. Симонян Г.М., Симонян Р.М., Симонян М.А. Лицензия изобрет. Армпатента, N 908. Ереван, 2001.
12. Симонян М.А., Симонян Г.М., Симонян Р.М. Лицензия изобрет. Армпатента, N 341. Ереван, 1997.
13. Симонян Г.М., Симонян Р.М., Бабаян М.А., Симонян М.А., Галоян А.А. Мед. наука. Армении, 2003, XLIII(1), 30-34.
14. Della R.F., Granata A., Braccio M. et al. Hemoglobin, oxi-dative stress in cancer. Anticancer Res., 1995, 15: 20892096.
15. Симонян Г.М. Мед.наука Армении, 2002, XLII(2): 101103.
16. Симонян Г. М., Нерсесян А. К., Симонян Р. М. и др. Нейрохимия, 2005, T.22, N.2, C.125-130.
17. Сираканян М.С., Симонян Г.М., Бабаян М.А., Симонян М.А. Вестник МАНЭБ Санкт-Петербурга, 2006, 11(8), стр.192-197.
18. Алексанян Сер.С., Степанян А. А., Симонян М.А. Вест-ник МАНЭБ Санкт-Петербурга, 2003, 8(7), с.164-167.
19. Juhasz A., Ge Y., Markel S., Chiu A., Matsumoto L.,van Balgooy J., Ray K., Doroshow J.H. Free Radic. Res., 2009, 43(6): 523-532.
20. Симонян P.M., Симонян Г.М., Симонян М.А. ДНАН РА, 2005, 105(4), 384-389.
21. Gius D., Spitz D.R. Redox signaling in cancer biology. Antioxid. Redox. Signal, 2006(7-8):1249-1252.

Вопросы, ответы, комментарии