Аффинный метод получения галектинов 1 и 3 с использованием эритроцитов в качестве матрицы

Введение

Лектины - это белки, которые обратимо и специфически связываются с углеводной частью глюкоконьюгатов (моно - и олигосахаридов мембран клеток и структур экстрацеллюлярного матрикса) без нарушения их структуры. Лектины могут быть как би- так и поливалентными, т.е. имеют два и более сайтов связывания с углеводами. Наряду со специфичностью поливалентность является одним из важнейших критериев для большинства лектинов [5]. Лектины обнаружены почти во всех организмах. Окончательная классификация лектинов еще не разработана, поэтому их объединяют или по общности функций или по углеводной специфичности. Среди лектинов важное место занимают галектины.

Галектины - это лектины животного происхожения, проявляющие специфичность по отношению к олигосахаридным цепям, содержащим остаток Б- га-лактозы [1,2]. Первые галектины были обнаружены в тканях электрического угря. В дальнейшем они най-дены во многих других организмах, включая позво-ночных (рыбы, птицы, земноводные, млекопитающие), беспозвоночных (черви и насекомые), а также простейших одноклеточных (грибки и губки), вирусы и некоторые растения [3,4]. По своему строению, все галектины имеют сходную внутреннюю последовательность из примерно 130 аминокислот, около 60-ти из которых принимают непосредственное участие в связывании с углеводом и содержатся в общем сегменте - углевод-связывающем домене. Галектины локализованы в ядре, цитоплазме, цитоплазматической мембране и экстрацеллюлярном матриксе, принимают участие в процессах пролиферации, дифференцировки, апоптоза клеток, морфогенеза тканей, канцерогенеза, метастазирования опухолей, что обьясняет возрастающий в последнее время интерес к изучению этой группы лектинов [6,7,9,10]. Физиологические функции разных галектинов сильно отличаются друг от друга и, кроме того, один и тот же галектин может выполнять разную роль в зависимости от взаимодействующего с ним в данный момент углеводного лиганда. Поэтому главным этапом в исследовании галектинов является изучение их углеводной специфичности, позволяющей не только выяснить необходимые для максимальной аффинности особенности строения углеводного рецептора, но и определить механизм связывания с олигосахарид- ной цепью. Более того, эти исследования необходимы и для выяснения биологической роли углеводного компонента, функции которого тоже зависят от его структуры. Галектины млекопитающих обозначают номерами в соответствии с последовательностью их открытия. К настоящему времени очищено порядка 20–и галектинов. Наибольший интерес ввиду их широкой распространенности и многообразия функций представляют галектины 1 и 3.

Галектин 1 участвует в клеточной адгезии, апоптозе, регуляции клеточного цикла, развитии опухолей. Он специфически локализован в лимфоидных органах, Т-клетках, эндотелиальных клетках, активирует макрофаги, принимает участие в аллергических реакциях [6,8,9,11,12]. Экспрессия галектина 1 в эндотелиальных клетках может быть вызвана также различными воспалительными агентами. Галектин 3 экспресируется в клетках различного происхождения, локализуется в ядре, цитоплазме, эндоплазмати- ческом ретикулуме, на поверхности клеток в составе гликокаликса, выполняет важную роль в различных физиологических и патологических процессах, включая межклеточное и клеточно-матриксное взаимодействие, рост клетки, неопластическую трансформацию, метастазирование, восстановление клеток после повреждения, апоптоз [13,14]. Онкогены и вирусы модулируют экспрессию галектина 3, вызывая увеличение его количества в некоторых опухолях. Кроме того, галектин 3 может являться диа-гностическим маркером при сердечно-сосудистой недостаточности, при опухолях щитовидной железы., толстой кишки, простаты, молочной железы. Поскольку галектины являются довольно консервативными белками, то их получение из органов различных млекопитающих и изучение свойств может выявить механизмы действия галектинов в организме человека. Галектины 1 и 3 обнаружены в различных органах и тканях: в печени, легких, сердечной мышце, мышечной ткани [2]. Одно из высоких содержаний галектинов 1 и 3 наблюдается в селезенке.

На сегодняшний день актуальным является разработка эффективных методов очистки галектинов. Аффинная очистка углевод-специфических белков на соответствущих матрицах может явиться таковой. На ранних этапах галектины получали с использованием их естественных, эндогенных лигандов, в частности, асиалофетуина, фибронектина, ламинина. Но все эти методы не получили дальнейшего применения. Позднее для очистки галектинов стали применять синтетические лактозил-иммобилизованные аффинные носители, в частности, лактозил-сефарозу, лактозил-агарозу, лактозил-сефадекс. Данная статья посвящена аффинной очистке галектинов 1 и 3 на их естественных, высокоспецифических лигандах.

Материл и методы

Приготовление трипсинизированных эритроцитов. Из левого желудочка сердца кролика отбирали 5-6мл крови (антикоагулянт-гепарин), 3 раза отмывали 5-и кратным избытком изотонического раствора (0,15М хлорид натрия), центрифугируя по 5 мин. при 1500х g. Затем готовили 10% суспензию эритроцитов в фосфатно-солевом буфере (0,15М хлорид натрия, 0,02М фосфат натрия рН 7.2). К суспензии добавляли равный обьем раствора трипсина в концентрации 2 мг/мл в том же буфере. Инкубировали 2 часа при 37^o С. Отмывали эритроциты 3 раза 5-ти кратным избытком фосфатно-солевого буфера , центрифугируя при 1000х g. Эритроциты хранили с 0,01% азидом натрия при 4^оС.

Получение галектинов. 100г. свежезамороженной бычьей селезенки гомогенизировали в 800мл раствора 0,1М хлорид натрия, 0,05М фосфат натрия, 0,01М бета-меркаптоэтанол, 0,002М ЕДТА, 0,05% азид натрия рН 7,3, затем добавляли сухую лактозу до конечной концентрации 0,3М и тритон Х-100 до 0,5%. Экстрагировали 2 часа при комнатной температуре и центрифугировали 30мин при 5000х g. Собирали фракцию между 40% и 60% насыщением сульфата аммония. Осадок суспендировали и диали- зовали против 0,02М натрий-фосфатного буфера рН 7,3 и наносили на колонку с ДЕАЕ-целлюлозой, объемом 30мл, заранее уравновешенную тем же буфером. Собирали несвязавшуюся с колонкой фракцию (фракция 1). Колонку тщательно промывали буфером до почти нулевого поглощения при длине волны 280нм. Элюировали раствором 0,15М хлорид натрия, 0.02М фосфат натрия рН 7,3. Собирали элюат (фракция 2). К осадку эритроцитов добавляли фракцию 1, заранее добавив хлорид натрия до изотонической концентрации. Выдерживали при комнатной температуре 30-40мин (до полной агглютинации), затем сгусток эритроцитов 3 раза отмывали 10-ти кратным избытком раствора 0,15М хлорид натрия, 0,02М фосфат натрия рН 7,3 при 500х g. Аффинно связавшийся галектин элюировали добавлением к агглю-тинированным эритроцитам 5-ти кратного избытка раствора 0,1М лактоза, 0,15М хлорид натрия, 0,02М фосфат натрия рН 7,3. Выдерживали 30-40мин при комнатной температуре (до полного раскрытия аг-глютинации), центрифугировали 5 мин при 1000 х g, отбирали надосадок (галектин 3). Вышеописанную процедуру проводили и с использованием фракции 2 (галектин 1). Полученные надосадки диализовали против фосфатно-солевого буфера и хранили при 4^оС с 0,01% азидом натрия.

Агглютинация. Готовили 4% суспензию трипси- низированных эритроцитов в фосфатно-солевом буфере. К 50мкл 4% суспензии эритроцитов добавляли равный обьем раствора галектина, инкубировали от 10мин до 2 часов при 40С, комнатной температуре и при 370С. Результаты оценивали визуально. Электрофорез. Гомогенность препарата галектина 1 определяли электрофорезом в неденатурирующих условиях в 7 % ПААГ[15]. Электрофорез галектина 3 проводили по методу Осборна в 7 % ДДС ПААГ [16]. Количество белка измеряли по экстинции при 280 нм Е^мг/мл ₂₈₀ 0.65 мл * мг^-1 * см^-1, для галектина 1 и Е^мг/мл

₂₈₀ 0.61 мл * мг^-1 * см^-1 для галектина 3.

Результаты и обсуждение

Как уже отмечалось, галектины специфически связывают углеводы, имеющие в своем составе остаток D-галактозы Учитывая это, следует обратить внимание на возможность очистки углевод- связывающих белков с применением их естественных, природных лигандов. Ранее нами предпринята попытка аффинного получения галектинов, используя групповые антигены эритроцитов человека. Однако, ввиду малых количеств лигандов метод предсталяется малоэффективным. Поскольку из всех исследованных эритроцитов, эритроциты кролика содержат наибольшое количество углеводов, специфичных для галектинов (агглютинация наблюдается при концентрации галектина 6мкг в мл), то возможно произвести очистку галектинов используя их способность агглютинировать эритроциты и конкурентно связываться с добавленными углеводами, высвобождая эритроциты. Разработанный метод позволяет предварительно, перед аффинной очисткой, разделить галектины методом ионообменной хромотографии, учитывая значительную отдаленность изоэлектрических точек галектина 1 (р1 4.8) и галектина 3 (р1 9).

Рис.1. Электрофореграмма галектина 1.

Рис.2.Электрофореграмма галектина 3 в ДДС ПААГ, в 7% ПААГ маркеры-БСА (67 кДА), овальбумин (45 кДА) и трипсин (24 кДА)

На рис. 1 изображена электрофореграмма галектина 1 в 7% ПААГ. Поскольку галектин 1 может присутствовать как в мономерной (14 кДа), так и димерной форме, то электрофорез на гомогенность представляется более информативным. На рис. 2 пред- сталена ДДС ПААГ электрофореграмма галектина 3 (29 кДА). В качестве маркеров использовались БСА , овальбумин и трипсин. Как видно из рисунков, описанным методом удается получить гомогенные препараты галектинов 1 и 3. Из 100 гр селезенки получали 1.5мг галектина 1 и 300мкг галектина.

Заключение

Таким образом, можно сказать, что разработан метод аффинной очистки галектинов с использованием их естественных специфических лигандов. Метод позволяет также производить аффинную очистку галектинов без предварительного применения хро-мотографических методов, т.е. из гомогената. Описанный способ можно использовать для получения всех, без исключения, галектинов.

Список литературы

1. Barondes SH, Cooper DN, Gitt MA, Letter H. Structure and function of a large family of animal lectins. JBC 1994 , 269, 20807-20810.
2. Baum LG, Seithamer JJ, Pang M, Levine WB, Beyon D, Berliner JA. Syntesis of an endogenios lectin, galectin 1, by human endothelial cells is up-regulated by endothelial cell activation. Glycoconjugate Journal 1995, 12, 63-68.
3. Blaser C, Kaufmann M, Muller C et al. Beta- galactosidebinding protein secreted by activated T cells inhibits antigen-induced proliferation of T cells. European J of Immunology 1998, 28, 2311-2319.
4. Cooper DH, Barondes SH. God must love galectins; he made so many of them. Glicobiology 1999, 9, 979-984.
5. Craig SS, Krishnaswamy P, Irani AM et al. Immunoelectron microscopic localization of galectin 3, an IgE binding protein, in human mast cells and basophils. Anatomical Records 1995, 242, 211-219.
6. Fuertes MB, Molinero LL, Toscano MA et al. Regulated expression of galectin 1 during T cells activation. Molecular and Cellural Biochemistry 2004, 267, 177-185.
7. Gil CD,La M, Peretti M, Oliani SM. Interaction of human neutrophils with endothelial cells regulates the expression of endogenous proteins annexin 1, galectin 1 and galectin 3.Cell Biology International. 2006, 30, 338-344.
8. Glinsky VV, Glinsky GV, Ritenhouse- Olson K et al. The role of Thomsen-Friedenreich antigen in adhesion of human breast and prostate cancer cells to the endothelium.
9. Houzelstein D, Goncaves IR, Fadden AJ et al. Philogenetic analysis of vertebrate galectin family. Molecular Biology and Evolution.2004, 21,1177-1187.
10. Hughes RC. Galectins as modulators of cell adhesion Biochimie 2001, 83, 667-676.
11. Inohara H, Segawa T, Miyauchi A et al.Cytoplasmic and serum galectin 3 in diagnosis of thyroid malignancies. BBRC 2008,376, 605-610.
12. Liu FT, Hou DK, Zuberi RI et al. Expresion and function of galectin 3, a beta-galactoside-binding lectin, in human monocytes and macrophages. American J of Patology 1995, 147, 1016-1028.
13. Liu PT, Paterson RJ, Wang JL. Intracellular function of galectins. BBA 2002, 1572, 263-273.
14. Liu FT, Rabinovich GA. Galectins as modulators of tumor progression. Nature Review cancer 2005, 5.
15. Davis BJ. Disc electrophoresis. Ann. NY Acad.Sci. 1964,121, 404-421.
16. Weber K, Osborn M. JBC, 1969, 244, 4406-4473.

Вопросы, ответы, комментарии