Исследование специфичности и степени сродства галектинов 1 и 3 к некоторым моно- и дисахаридам

Введение

Последние достижения в области гликобиологии позволяют по новому взглянуть на роль углеводов. В настоящее время система углевод-белкового узнавания рассматривается как дополнительная к генетическому коду, суть которой заключается в следующем. Как известно, углеводы предсталены в виде гликопротеинов, гликолипидов и полисахаридов, обладающих огромным потенциалом кодирования биологической информации. Если в пептидах и олигонуклеотидах информация кодируется числом аминокислот или нуклеотидов и их последовательностью, то в случае углеводных структур - также конфигурацией и положением связи. Так, две молекулы одного моносахарида ,например, глюкозы, могут образовать 11 различных дисахаридов, тогда как две молекулы одной аминокислоты или нуклеотида могут образовать, соответственно, только один дипептид или один динуклеотид. Благодаря этому создается уникальная возможность кодирования биологической информации. Процесс присоединения сахаров известен как гликозилирование. Большинство белков клеточной поверхности гликозилированы,что играет важную роль процессах межклеточного и клеточно- матриксного взаимодействия. Нарушение углеводного состава клеточной поверхности характерно для огромного числа патологий. Олигосахаридные цепи клеточной поверхности животных построены из шести моносахаридов: маннозы, галактозы, фукозы, N-ацетилглюкозамина, N-ацетилгалактозамина и нейраминовой кислоты, к которым и имеют сродство различные лектины. Лектины, специфически связы-вающие углеводы белки, являются универсальным инструментом в исследовании структуры углеводных цепей и выявления нарушений гликозилирования при различных патологиях. Галектины- животные лектины, проявляющие специфичность по отношению к олигосахаридным цепям, содержащим остаток D-галактозы, играют важную роль в процессах адгезии клеток, их деления, роста, неопластической трансформации, метастазирования опухолей [1,2,3]. Физиологические функции разных галектинов сильно отличаются друг от друга и, кроме того, один и тот же галектин может выполнять разную роль в зависимости от взаимодействующего с ним в данный момент углеводного лиганда [4,5,7]. Поэтому главным этапом в исследовании галектинов является изучение их углеводной специфичности, позволяющей не только выяснить необходимые для максимальной аффинности особенности строения углеводного рецептора, но и определить механизм связывания с олиго- сахаридной цепью. Более того, эти исследования необходимы и для выяснения биологической роли углеводного компонента, функции которого тоже зависят от его структуры. Принимая во внимание широкое участие галектинов в процессах трансформации и метастазирования, в частности, галектин 3 способствует прикреплению опухолевой клетки к нормальной путем связывания с богатыми углеводами муцинами последней [6], можно рассматривать специфические для галектинов сахара в качестве привентивной меры для предупреждении метастазирования и при противоопухолевой терапии [8,9]. В работе ис-пользовались галектины, полученные путем аффинной очистки на эритроцитах кролика.

Материал и методы

Приготовление трипсинизированных эритро-цитов. Из левого желудочка сердца кролика отбирали 5-6мл крови (антикоагулянт-гепарин), 3 раза отмывали 5-и кратным избытком изотонического раствора (0,15М хлорид натрия), центрифугируя по 5 мин. при 1500х g. Затем готовили 10% суспензию эритроцитов в фосфатно-солевом буфере (0,15М хлорид натрия, 0,02М фосфат натрия рН 7.2). К суспензии добавляли равный обьем раствора трипсина в концентрации 2 мг/мл в том же буфере. Инкубировали 2 часа при 37^о С. Отмывали эритроциты 3 раза 5-ти кратным избытком фосфатно-солевого буфера, центрифугируя при 1000х g. Эритроциты хранили с 0,01% азидом натрия при 4^оС.

Получение галектинов. Галектины 1 и 3 получали методом аффинной очистки с использованием эритроцитов в качестве матрицы, описанным нами в предыдущей статье (стр.47-49). Агглютинация. К 4% суспензии трипсинизированных эритроцитов кролика добавляли равный обьем раствора галектина в фосфатно-солевом буфере. Концентрация белка 20, 50 и 100, 200мкг/мл. Инкубировали при комнатной температуре 20, 40, 60 мин. Уровень агглютинации оценивали визуально. Ингибирование агглютинации проводили добавлением к агглютинированным эри-троцитам равного обьема физиологического раствора с содержанием углеводов в концентрациях 0.1 М,0.2М, 0.3М. Степень ингибирования агглютинации определяли по пропусканию света в видимом диапозоне при длине волны 620нм.

Результаты и обсуждение

Способность галектинов связывать углеводы зависит от конфигурации и положения связи в молекуле гликоконьюгата. Исследование механизмов узнавания и связывания галектинов с сахарами, а также получение синтетических глюкоконьюгатов в качестве ингибиторов связывания являются перспективными для диагностики, профилактики и лечения патологий, обусловленных нарушением гликозилирования и гликоузнавания. Исследовано сродство галектинов 1 и 3 к сахарам, имеющем в своем составе галактозу, а также к моносахаридам, широко пред-ставленным в организмах. Галектины являются гемагглютининами, т.е.агглютинируют эритроциты, образуя мостики между специфическими для них углеводами мембран. При добавлении специфических сахаров происходит их конкурентное связывание с галектином и высвобождение эритроцитов, так называемое, раскрытие агглютинации.

В таблице 1 представлены результаты временной зависимости агглютинации эритроцитов от кон-центрации галектина. Как видно из таблицы галек- тин 1 имеет более высокую способность к агглютинации, т. к. вызывает полную агглютинацию эритроцитов при инкубировании 20мин и наименьшей концентрации белка 20 мкг/мл. В случае галектина 3 полная агглютинация наблюдается через 60 мин при концентрации белка 20 и 50 мкг/мл, и даже при пяти- и десятикратном по сравнению с галектином 1 уве-личении концентрации белка полная агглютинация происходит после 40 мин. инкубации.

Таблица 1. Зависимость времени (мин) агглютинации эритроцитов от концентрции галектинов

В таблице 2 показаны результаты ингибирования агглютинации, вызванной галектинами, различными сахарами. Галектин 1 проявляет специфичность только к лактозе, а галектин 3, помимо лактозы, имеет сродство к метил-галактопиронозиду при концетрации 0.3М. Результаты количественной оценки ингибирования агглютинации лактозой и метил- галактопиранозидом представлены в виде диаграммы на рис.1. За 100% принимается пропускание света при длине волны 620 нм физ .раствора. Контрольная суспензия эритроцитов имеет пропускание 4.68%±0.05 (А). При ингибировании агглютинации лактозой пропускание для галектина 1 и га- лектина 3 соответственно равно 4.56%±0.05 (В) и 4.72%±0.05 (С), что соизмеримо с контролем, то есть можно сказать,что лактоза полностью ингибирует агглютинацию, вызванную галектинами. В случае 

Рис.1. Диаграмма степени сродства галектинов к лактозе и метилгалактопиранозиду.

метил-галактопиранозида, добавленного к галектину 3,пропускание равно 32.8% ± 0.1 (Б). Если принять за полное ингибирование пропускание контрольной суспензии, то можно сказать, что происходит частичное ингибирование агглютинирующей способности галектина 3 метил- галактопиранозидом.

Таблица 2. Ингибирование моно- и дисахаридами агглютинации эритроцитов, вызванной галектинами

Заключение

Таким образом показано, что галектины, полученные в результате аффинной очистки на естествен-ных лигандах, а именно, эритроцитах кролика, из ис-следованных сахаров имеют абсолютное сродство только к лактозе, а галектин 3 также имеет некоторое сродство к метил-галактопиранозиду.

Список литературы

1. Barondes SH, Cooper DN, Gitt MA & Leffler H Structure and function of a large family of animal lectins. Journal of Biological Chemistry 1994, 269, 20807-20810.
2. Raz A, Lotan R.Endogenous galactoside-binding lectins; a new class of functional tumor cell surface molecules related to metastasis. Cancer Metastasis rev 1987, 6, 433452.
3. Raz A, Zhu D, Hogan V, Shah N. evidence for the role of galactoside-binding lectin in transformation and metastasis. Int J Cancer 1990, 46, 871-877.
4. Thijssen VL, Postel R, Brandwijk RJ et al. Galectin 1is essential in tumor angiogenesis and is a target for antiangiogenesis therapy. PNAS 2006, 103, 15975-15980.
5. ThijssenVL, Poirier F, Baum LG, Griffioen AW. Galectins in the tumor endothelium; opportunities for combined cancer therapy. Blood 2007, 110, 2819-2827.
6. Tonscano MA, Bianco GA, Ilarregui JM et al. Differential glycolisatyion of TH1, TH2 and TH17 effector cells selectively regulates susceptibility to ceel death. Nat Immonol 2007, 8, 825-834.
7. Yang RY, Hsu DK, Liu FT. Expression of galectin 3 modulates T cell grownh and apoptosis.PNAS 1996, 93, 6737-6742.
8. Yang RY, Rabinovich GA, Liu FT. Galectins; structure,function and therapeutic potential. Expert Rev Mol Med 2008, 10, 17.
9. Yu LG, Andrews N, Zhao Q et al. Galectin 3 interaction with Thomsen-Friedenreich disaccharide on cancer- associated MUC1 causes increased cancer cell endothelial adhesion. JBC 2007, 282, 773-781.

Вопросы, ответы, комментарии