Повышение уровня и nadph зависимой супероксид-продуцирующей и снижение ферригемоглобин-восстанавливающей активностей изоформ nadph оксидаз из клеток тканей крыс при цисплатин-индуцированной нефротоксичности и регулирующий эффект N-ацетилцистеина

Известны различного характера эспериментально смоделированных нефротоксичностей, ассоции-рованных с почечной недостаточностью. При этом экзогенные защитные системы, которые в подавляющем большинстве имеют антиоксидантный характер, действуют в основном адекватным образом. Так, при циклоспорин А - индуцированном апоптозе и некрозе NAK-52 E клеток сосудов почек in vitro некро- статин существенно снижает число гибели этих клеток, путем снижения уровня активных форм кислорода (АФК) [7]. При гентамицин-индуцированном нефротоксикозе крыс определенную роль придается высоконасыщенным жирным кислотам из пальмового жира, которые усиливают нефротоксикоз почек животных, при этом препарат эигелол играет защитную роль, снижая фон оксидативного повреждения [2,12]. Антиинфламаторный цитокин ИЛ-10, экспрессиуремый из клеток, также играет защитную роль при почечной недостаточности, индуцированной липокалином-2 [3]. В результате подачи крысам литиум карбоната (2г/кг) совместно с кормом в течение месяца происходит оксидативное повреждение клеток печени и почек с повышением ПОЛ, активности СОД и каталазы, однако, активность ГПО снижается. Эти изменения ассоциированы с экспрессией стрессорного белка HSP72/73 на фоне усиления почечной недостаточности [5]. Нынче более интенсивно исследуются механизмы цисплатин (ЦИП) инду-цированной нефротоксичности (как более эффектив-ный агент) и пути защиты. Механизмы такого действия ЦИП ассоциированы со снижением скорости кровотечения и гломерулярной фильтрации почечной ткани, стимуляции некроза и апоптоза клеток сосудов почек, с повышением перекисного окисления липидов (ПОЛ), со снижением активности эндогенных антиоксидантов, повышением экспрессии вос-палительных маркеров и увеличением активности каспаз-3 [10]. При ЦИП (до 7мг/кг) -индуцированной нефротоксиксичности и почечной недостаточности защитный эффект оказывают: рекомбинированный эритропоетин человека, который оказывает ан- тиапоптический эффект [4,9], карносиковая кислота [6], а также антивоспалительный препарат целекок- сиб (30мг/кг), который является избирательным ингибитором циклооксигеназы-2, поданного в течение 5 дней [8]. При этом, как более эффективное средство при почечной недостаточности получило широкое применение препарат с высокой антиоксидантной активностью N-ацетилцистеин [11]. Исследования в этой области, ассоциированные с комплексным определением уровня металлопротеинов антиоксидантной активности (МАА) и металлопротеи- нов прооксидантной активности (МПА) - изоформ NADPH оксидазы (Nox) из крови больных людей при различного характера почечных заболеваний немногочисленны [13-15]. Однако, роль NADPH оксидазы (Nox), как ключевой системы продуцирования супе- роксидных радикалов в иммунных и других клетках, нельзя недооценивать и при почечных заболеваниях.

Целью исследования являлось определение уровня и активности изоформ Nox из эритроцитарных мембран (ЭМ) и субклеточных образований клеток органов иммунной системы (селезенка, костный мозг) крыс при ЦИП-индуциированной нефротоксичности в отсутствии и присутствии N-ацетилцистеина.

Материал и методы. Белые половозрелые крысы, весом 220-250г разделены на три группы (по 8 крыс). В первой группе животным вводили внутри- брюшинно по 0,5мл физ. раствора, 3 раза в течение трех недель (контрольная группа- К), второй группе животным вводили внутрибрюшинно по 7мг/кг ЦИП в приведенном режиме (опытная группа - ОГ- 1), в ОГ-2, после введения животным ЦИП, одновременно вводили и N-ацетилцистеин (по 10мМ) также приведенным образом. Для выделения и очистки металлопротеинов крови и клеток тканей контрольных, ОГ-1 и ОГ-2 крыс, были использованы целлюлозы DE-52, KM-52 («Whatman», Англия) и сефадексы ДЕАЕ А-50 и G-100 (“Pharmacia”, Швеция). Для определения супероксид (О₂)-продуцирующей активности Nox были использованы нитротетразолие- вый синий (НТС), феназин метасульфат (ФМС), пирофосфат натрия, динатриевая или тетранатриевая соль NADPH фирмы «Sigma» (США). Для приготовления буферных растворов использовали одно- и двухзамещенный фосфат калия (марки «чистый для анализа»). Для изменения рН растворов использовали соляную кислоту. Электрофорез белков был осуществлен на приборе венгерского производства с соответствующими реактивами и приспособлениями. Используемые ЦИП и N-ацетилцистеин получали из фирмы «Sigma». Остальные используемые реактивы (натрий хлористый, KOH, сахароза и др.) также были маркой “чистый для анализа”. Для размельчения (гомогенизации) тканей в 0,25М сахарозе был использован стеклянный гомогенизатор с тефлоновым пестиком. Для проведения ионообменной хроматографии были использованы стеклянные колонки со стеклянными фильтрами размерами: 4x30 см, 2x20 см, 1x15 см, а для гель-фильтрации: 3x90 см и 2x70 см. При очищении эритроцитарных мембран, ядер, митохондрий и мембран клеток тканей были использованы центрифуги К-24 и К-70 («Veb MLW Zentrifugenbaum Engelsdorf», Германия). Оптические спектры поглощения были регистрированы на спектрофотометре тре Specord UV/VIS (Германия), длиной оптического пробега-1см. Статистическую обработку полученных результатов осуществляли общеизвестным методом вариационной статистики Стьюдента-Фишера, с определением критерия достоверности р.

Используемые методы. Для выделения и очистки изоформ Кох из эритроцитарных мембран (ЭМ), мембран клеток селезенки (МКС), ядер клеток селезенки (ЯКС), митохондрий клеток селезенки (МИКС), а также из клеток костного мозга крыс были использованы лицензированные способы [16,17]. Выделение и очистка Nох из эритроцитарных мембран у крыс. Из крови крыс эритроциты осаждали добавлением к ней физ .раствора (1:20мл). После центрифугирования осажденных эритроцитов при (при 6000об/мин, 5мин) их подвергали гемолизу в воде (1:10об/об). ЭМ осаждали центрифугированием гемолизата при 6000об/мин (при рН 5,6) в течение 15мин. Далее осажденные ЭМ повторно смешивали с водой (1:200об/об) и после центрифугирования в аналогичных условиях осажденные ЭМ смешивали с водой (1:10) и осуществляли процесс солюбилизации фракции Кох из этой смеси. После диализа против воды и центрифугирования смеси, из надосадочного раствора фракцию Кох получали ионообменным хроматографированием сначала на колонках с целлюлозами КМ-52, а затем с ДЕ-52. Из последней колонки Nох элюировали 0,2М калий фосфатным буфером (КФБ). В результате гель фильтрации Кох на колонке с сефадексом 0-100, центральная фракция имела электрофоретическую чистоту (как это показали электрофореграммы). Выделение изоформ Ыох из мембран митохондрий и ядер клеток селезенки крыс. Метод получения Кох из МКС, ЯКС и МИКС включает следующие процедуры [17]. После промывания тканей (по 2г) физиологическим раствором и взвешивания, гомогенизацию проводили в 0,25М сахарозе (1г ткани в 10мл сахарозы) стеклянным гомогенизатором с тефлоновым пестиком в течение 1мин при 4^оС. Ядра клеток селезенки (ЯКС) осаждали центрифугированием гомогената при 3000об/мин в течение 10мин. Митохондрии осаждали после центрифугирования надосадочного раствора при 12000об/мин в течение 15мин. После промывания МКС, ЯКС и МИКС водой (1:500 об/об), солюбилизации фракции Кох, диализа надосадочного раствора и центрифугирования, супернатант подвергали ионообменной хроматографии на отдельных колонках с целлюлозой КМ-52 и БЕ-52. Из последней колонки фракцию Кох элюировали 0,1М КФБ. Выделение фракции Nох из клеток костного мозга крыс. Суммарную фракцию изоформ Кох из клеток костного мозга (ККМ) выделяли аналогичным методом [17], не отделяя клеточные компоненты. Выделение фракции еЫох из сыворотки крови крыс. Следы эритроцитов и клеток плазмы из сыворотки крови были удалены путем их центрифугирования при 14000об/мин, 15мин. Сыворотку крови (10мл и выше) инкубировали в течение 4-х суток в аэробных условиях при 4^оС с электрофоретически гомогенным ферригемоглобином (2,5 x10^-6, 5*10^-6, 15*10^-6М) из цитозоли эритроцитов крыс. После центрифугирования инкубационного раствора в приведенных условиях, в течение 15мин и разбавления супернатанта водой (20раз) еNoх из этого раствора выделяли ионообменной хроматографией сперва на колонке с сефадексом ДЕАЕ А-50 с элюированием фракции eNox 0,04М калий-фосфатным буфером, pH 7,4 (КФБ). После разбавления элюата водой (20раз) осуществляли ee ионообменную хроматографию на колонке с целлюлозой КМ-52 (для удаления следов гемоглобина и других белков основного характера). Не задерживающуюся на этой колонке белковую фракцию пропускали через колонку с целлюлозой ДЕ-52 (уравновешенную 0,004М КФБ), из которой фракцию еNoх элюировали также 0,04М КФБ. Далее эту фракцию еNoх пропускали через колонку с сефадексом G-100, уравновешенную 0,04М КФБ, собирали и концентрировали центральную электро- феретически гомогенную фракцию [18]. Количество Nox определяли путем измерения плотности максимального оптического поглощения раствора Nox при 530нм (β полоса поглощения). Удельное содержание Nox из клеток тканей определяли из рассчета на 1мл раствора Nox полученного из 1г ткани и 1мл эритроцитов. Определение О₂^--продуцирующей активности изоформ Nox. О₂^- -продуцирующую активность изоформ Nox определяли нитротетрозолиевым синим (НТС) методом, путем вычисления процента стимулирования образования формазана (при 560нм) в результате восстановления НТС супероксидными радикалами. За единицу О₂^-продуцирующей активности принимали количество белка, которое стимулирует образование формазана на 50%. При этом NADPH зависимую О₂^-продуцирующую активность Nox определяли добавлением к реакционной системе NADPNa₄ (10^-4 М). В этой реакционной смеси (3мл) величина плотности поглощения Nox (при 530нм) составляла 0,03.Определение ферриHb- восстанавливающей активности изоформ Nox. Ферригемоглобин (ферриHb)-восстанавливающие активности изоформ Nox определяли основываясь на том, что при аэробном инкубировании Nox и ферриHb, происходит восстановление ферриHb до ферроHb in vitro. В частности, был использован электрофорети- чески гомогенный ферриHb из эритроцитов крыс. К 3мл этого ферриHb (с А₅₆₅=0.9) добавляли Nox с объемом 0,1мл и с А^о₅₃₀=0,3 (плотность оптического поглощения β-полосы на оптическом спектре матричного раствора изоформ Nox). После дабавления Nox к раствору ферриHb без перемешивания ставили реакционную смесь в термостат при 36^о в течение 5-6ч. Далее реакционные смеси помещали в стеклянные трубки (5x1см) и регистрировали кинетику снижения изменение плотности a-поглощения (при 565нм) ферриНb, инкубировав реакционную смесь в течение 4-х ч при 20^о. Постепенное восстановление ферриНb до ферроНb сопровождается снижением плотности а-поглощения ферриНЬ. Это снижение прямо пропорционально образованию ферроНb (при 555нм). За единицу ферриНb-восстанавливающей активности принимается количество Кох или цитохрома b558, вызывающее снижение плотности а-поглощения ферриНb до 0,05 в течение 30мин при 20^о [19].

Результаты и обсуждение. В результате нефротоксичности, обостряющегося в течение трех недель в приведенных условиях, наблюдается существенное повышение эндогенного уровня изоформ внутриклеточной Кох в внеклеточной еКох в сыворотке крыс, по сравнению с 100% контрольными показателями. Такое резкое повышение уровня еNох, в сыворотке крови крыс (табл.1) скорее всего связано с ослаблением стабильности эритроцитов, когда происходит некоторый гемолиз эритроцитов и проникновение гемоглобина (НЬ) в сыворотку крови [18].

Табл.1. Относительнoe измененж уровня (плотность максимального оптического поглощения β-полосы при 530нм) Nox в К, ОГ-1 и ОГ-2 пробах (П =6, р‹0,05)

В этих условиях за счет образования нестабильного комплексного соединения между Нb и Nох в экзосомах происходит переход экзосомной Кох из гетерогенной фазы в гомогенную фазу (в сыворотку) [18]. Этот процесс усиливается при повышении ПОЛ, что в действительности наблюдается при нефротоксикозе [5]. Увеличение уровня изоформ Кох в субклеточных формированиях клеток органов иммунной системы (селезенка и костный мозг) адаптационными системами клеток ассоциировано со стимулированием иммунной системы для увеличения достаточного уровня протекания различного характера аэробных метаболических процессов. Однако, чрезмерное «бесконтрольное» увеличение уровня продуцируемых NADPH оксидазой О₂^-является новым механизмом ЦИП-индуцированном нефротоксикозе. При этом, под влиянием эффективного антиоксиданта N-ацетилцистеина эти биохимические показатели приближаются к норме (табл.1). С другой стороны NADPH зависимая О₂^- продуцирующая активность этих Кох несколько повышается при ЦИП-индуцированном нефротоксикозе, а N-ацетилцистеин путем подавления этой активности несколько предотвращает оксидативное повреждение клеточных компонентов, продуцируемыми О2^- (табл.2).

Табл. 2. Относительное изменение NADPH зависимой О₂^- - продуцирующей активности Nox в К, ОГ-1 и ОГ-2 пробах (n =6, n =6, p‹0,05)

Другим механизмом ЦИП-индуцированного нефротоксикоза является подавление кислородного гомеостаза, путем снижения ферриНЬ- восстанавливающей активности, приведенных Nох (табл.3).

Табл. 3. Относительное изменение ферриHb- восстанавливающей активности Nox в К, ОГ-1 ОГ-2 пробах (n =6, p‹0,05).

Хотя под влиянием К-ацетилсистеина на-блюдается определенное увеличение ферриНЬb восстанавливающей активности изоформ Кох, однако механизм такого эффекта еще не определен.

Можно заключить, что при ЦИП- индуцированном нефротоксикозе механизмы оксидативного повреждения компонентов клеток органов иммунной системы и эритроцитарных мембран ассициированы с существенным повышением уровня NADPH зависимой О₂^- - продуцирующей и снижением ферриНb-восстанавливающей активностей изоформ Nох, а путем регулирования этих биохимических показателей N-ацетилцистеин оказывает антистрессорный и защитный эффект.

Список литературы

1. Ouyang Z, Zhu S, Jin J, Li J, Qiu Y, Huang M, Huang Z. 4. Pharmazie. 2012,67(8):725-732.
2. Ibraheem ZO, Sattar MA, Rathore HA, Johns EJ. Bosn J 5. Basic Med Sci. 2012, 12(1):26-32.
3. Jung M, Sola A, Hughes J. et al. Kidney 6. Int. 2012,81(10):969-982.
4. Rjiba-Touati K, Boussema IA, Belarbia A, Achour A, Bacha H. Int J Toxicol. 2011, 30(5):510-517.
5. Nciri R, Allagui MS, Bourogaa E. et al. J.Physiol Biochem. 2012, 68(1):11-18.
6. Sahu BD, Rentam KK. et al. Food Chem Toxicol. 2011,49(12):3090-3097
7. Galichon P, Vittoz N, Xu-Dubois YC. et al.Transplantation. 2011, 15;92(9):993-998.
8. Suddek GM, El-Kenawi AE, Abdel-Aziz A, El-Kashef HA. Chemotherapy. 2011;57(4):321-6.
9. Rjiba-Touati K, Ayed-Boussema I, Bouaziz C, Belarbia A, Azzabi A, Bacha H. 2012,35(1):89-95.
10. Sanchez-Gonzalez PD. et al. Nephrol Dial Transplant. 2011 Nov;26(11):3484-95.
11. Hanly LN, Chen N, Aleksa K, Cutler M, Bajcetic M, Palassery R, Regueira O, Turner C, Baw B, Malkin B, Freeman D,Rieder MJ, Vasylyeva TL. et al. J Clin Pharmacol. 2011,52(1):55-64.
12. Said MM. Fundam Clin Pharmacol. 2011,25(6):708-16.
13. Алексанян А.С., Симонян Р.М., Симонян Г.М. и др.Мед. Наука Армении, 2006, 2:52-56.
14. Алексанян А.С. Вестник МАНЭБ Санкт-Петербурга,2006, 11(8): 180-183.
15. Алексанян А.С., Бабаян М.А., Галоян А.А., Симонян М.А. ДАН РА, 2007, 107(3): 254-262.
16. Симонян Г.М., Симонян Р.М., Симонян М.А. Способ получения цитохрома b558 из эритроцитарных мембран. Лицензия изобрет. Армпатента, No 908. Ереван,2001.
17. Симонян Г.М., Симонян Р.М., Симонян М.А. Способ получения цитохрома b558 из клеточных компонентов. Лицензия изобретения Армпатента No 2233А,2008.
18. Фесчян С.М., Симонян Р.М., Енгибарян А.А., Симонян М.А. Вопр. Теорет. Клин. Мед., 2012, 15(4): 12-16.
19. Simonyan G.M, Simonyan R.M., Simonyan M.A. Electr.J. of Natural Sci. NAS RA, 2006, 2(7), 3-6.

Вопросы, ответы, комментарии