Локализация и активность NO-синтазы в тканях небных миндалин у детей при хроническом декомпенсированном тонзиллите

Ключевые слова: хронический тонзиллит, NO-синтаза, ретикулярный эпителий

Проблема хронического тонзиллита остается одной из актуальных в современной детской оториноларингологии, являясь самой частой причиной хирургических вмешательств [2].

Небные миндалины, являясь структурными компонентами лимфоглоточного кольца, как часть мукозоассоциированной иммунной системы, обеспечивают слизистые оболочки верхних дыхательных путей и желудочно-кишечного тракта иммунокомпетентными клетками, контролируя активность местного иммунитета. Одновременно являясь органом иммунитета, небные миндалины, подвергаясь постоянному экзогенному воздействию инфекционных агентов и их антигенов, часто сами становятся источниками очаговой инфекции [4]. Последнее обстоятельство придает особое значение морфофункциональному анализу небных миндалин при так называемой тонзиллярной болезни, которая представляет собой постоянное иммунореактивное состояние миндалин лимфаденоидного кольца, возникающее в связи с обострениями очаговой бактериальной инфекции и поддерживаемое антигенной стимуляцией содержимого крипт небных миндалин, и лакун носоглоточных минадлин [3]. Постоянная сенсибилизация организма стрептококковыми антигенами при хроническом тонзиллите нередко становится причиной таких сопряженных заболеваний, как ревматизм и острый гломерулонефрит. Установлено наличие внутритканевых стрептококковых очагов в небных миндалинах, что, однако, еще не является доказательством хронического тонзиллита [4]. В лимфоэпителиальных органах, каковыми являются небные миндалины, созданы оптимальные условия для дифференцировки и созревания лимфоцитов, в особенности в зонах лимфоэпителиального симбиоза (ЛЭС). Покровный эпителий крипт и лакун миндалин является своеобразным микроокружением, где созданы все необходимые условия для распознавания чужеродных антигенов, активирования и созревания лимфоцитов. В местах наиболее тесного контакта лимфоцитов с эпителиоцитами, в зонах ЛЭС, покровный эпителий представлен специальным типом эпителия, называемым ретикулярным, уникальная структура которого позволяет иммунокомпетентным клеткам проникать в поверхностные слои, ближе к просветам крипт и лакун. В силу современных научных данных, ретикулярный эпителий можно рассматривать как истинное микроокружение лимфоцитов, а ЛЭС зоны как иммунорегуляторную единицу миндалин, позволяющую наряду с лимфоцитопоетической функцией, осуществлять функции своеобразного регионарного центра, контролирующего иммунный барьер слизистых оболочек [3]. Таким образом, небные миндалины являются уникальными органами иммунной защиты, где бурно протекающие процессы созревания и активации иммунных клеток проходят в условиях постоянной антигенной стимуляции.

Исследования последних 20 лет, посвященные открытию оксида азота (NO) и направленные на его изучение, выявили многочисленные звенья его функционирования в различных биологических системах [5,7,8,12,13]. Будучи бесцветным газообразным соединением, NO является внутри- и межклеточным вторичным мессенджером (нейропередатчиком) и паракринным (влияющим на функцию соседних клеток) соединением [1]. Образование NO в организме человека происходит с помощью фермента NO-синтазы (NOS).

В литературе описаны две основные формы NOS: конститутивная NOS (kNOS), которая находится в сосудистом эндотелии (eNOS) и мозге (nNOS), и индуцибельная NOS (iNOS), локализованная в активированных макрофагах.

Изоформы (NOS)

Среди множества физиологических функций NO, важнейшими являются регуляция тонуса кровеносных сосудов, ингибирование агрегации и адгезии тромбоцитов на стенках кровеносных сосудов, функционирование в центральной и периферической нервной системе, регуляция деятельности органов дыхания, желудочно-кишечного тракта и мочеполовой системы [9,16].

Помимо сугубо физиологических ролей, NO играет также важную роль в патологических процессах. В частности доказана роль NO в механизмах регуляции апоптоза [10,17]. Имеются работы, посвященные непосредственной роли NO в патогенезе острой почечной недостаточности [11]. Доказано разрушительное действие NO и продуктов его метаболизма на молекулу ДНК с возможным нарушением нормальных клеточных циклов [6]. Доказано также, что NO и продукты его дальнейшего метаболизма, расщепляют хондроитинсульфаты, что может иметь большое значение в патогенезе воспалительного процесса [14]. NO играет исключительно важную роль в механизмах защиты макроорганизма от микробов, так как: 1) молекула NO обладает антимикробным эффектом, 2) в связи с взаимодействием NO со свободными кислородными радикалами образуется множество антибактериальных метаболитов, способных повреждать ДНК бактерий, 3) продукция NO повышается при защитных реакциях организма, 4) генетическая инактивация iNOS в эксперименте у животных резко понижает антимикробную защиту [16]. Установлено также, что некоторые грамположительные бактерии имеют NO-синтазную активность. В частности, доказано наличие NOS у Bacillus Subtillis, Bacillus Antracis, Staphilococcus Aureus, функциональное значение которой пока что остается невыясненной [15].

Исходя из вышеизложенного, представляется интересным изучение активности и локализации NOS в тканях небных миндалин, и его значение в патогенезе хронического воспаления в условиях пресистированной внутритканевой стрептококковой инфекции.

Целью настоящей работы является гистохимическое определение NOS в тканях небных миндалин при хроническом декомпенсированном тонзиллите с выяснением ее активности и локализации в зависимости от давности заболевания и активности воспалительного процесса.

Материал и методы. Исследовались небные миндалины, удаленные при операции тонзиллэктомии у 35 детей в возрасте от 3 до 14 лет, страдающих хроническим декомпенсированным тонзиллитом. В анамнезе у больных отмечались частые рецидивы по типу острых гнойных ангин. На базе лабораторного отделения МЦ Арабкир бактериологическим методом из слизи зева были выделены патогенные штаммы гемолитического стрептококка группы А. В сыворотке крови определялись повышенные титры антистрептолизина-О. По общепринятой возрастной периодизации больные были разделены на 2 группы: I–от 3 до 7 лет, II–от 7 до 14 лет.

Для определения активности и локализации NOS на криостатных срезах поставлена гистохимическая НАДФH-диафоразная реакция по Vincent и Kimura [19]. Метод основывается на образовании темно-синего пигмента формазана из нитросинего тетразолия под воздействием фермента NOS и кофермента НАДФН. Применялся гистохимический метод на выявление в сосудах кислой фосфатазы по С.А. Сисакяну. Ставилась иммуногистохимическая реакция для определения антигенов эндотелиальных клеток CD34 по методу APAAP (Alkaline Рhosphatase Anti Alkaline Phosphatase) на базе кафедры патологии Геттингенского медицинского института (Германия). Гистологические препараты окрашивались методом Грам-Вейгерта по модификации Н.Д. Вартазаряна, гематоксилином и эозином по Гимзе и толуидиновым синим по общепринятым методикам.

Результаты и обсуждение. Исследования показали, что распределение и активность NOS в тканях небных миндалин носят неравномерный характер. Учитывалось то обстоятельство, что основными источниками сосудистого русла миндалин являются артерии мышечного типа, расположенные в соединительнотканой строме органа, которые сопровождаются двумя венами-спутницами. Активность эндотелиальной NOS была заметна только в сосудах, расположенных в строме. Причем ее активность в артериях была выше чем в венах. Цитоплазма эндотелиальных клеток окрашивалась диффузно, причем более интенсивно в артериях чем в венах. В строме и в межфолликулярной лимфоидной ткани, выявлялись множественные, периваскулярные дегранулирующие тучные клетки, не отличающиеся NOS активностью. В эндотелии сосудов межфолликулярной лимфоидной ткани, а также капилляров фолликулов NOS активности не выявлялось. Эти данные позволяют считать, что низкий уровень NO сосудов межфолликулярной лимфоидной ткани, а также капилляров фолликулов при хроническом декомпенсированном тонзиллите является показателем пониженной функциональной активности микроциркуляторного русла и нарушения адекватного кровотока. Об этом свидетельствуют также наши данные о наличии в сосудах микротромбов при низкой активности NOS в эндотелии. Важным и интересным, на наш взгляд, явилось обнаружение высокой активности NOS в клетках покровного ретикулярного эпителия крипт. Причем активность фермента определялась во всех слоях эпителия, тем самым визуализируя всю толщу ретикулярного эпителия, что не всегда удается обнаружить на обычных гистологических препаратах. Самая высокая активность фермента определялась в зонах ЛЭС и в зонах вокруг разветвленных капилляров сосочковых образований, проникающих в слой покровного многослойного плоского эпителия. При этом капиллярная сеть, ее густота, размеры и форма капиллярных петель была неоднородна в различных отделах миндалин. Более густая капилляризация наблюдалась в участках непосредственно под ретикулярным эпителием, а также в сосочковых структурах покровного эпителиального слоя, где сосуды отличались извилистостью, наличием по их ходу сложных по структуре петлевидных и клубочковидных образований.

Известно, что повышенная иммунореактивность организма при хроническом тонзиллите обусловлена постоянным присутствием в криптах небных миндалин бактериальной флоры [3,4]. В криптах изученных нами миндалин также выявлялись скопления множественных грамположительных микробов, часто образующих колонии. Вокруг таких крипт, непосредственно под эпителием определялись кровеносные капилляры в непосредственном контакте с разрыхленным эпителием и содержимым крипт. Высокую активность NOS в эпителиальном покрове, а следовательно, высокие концентрация NO, параллельно с наличием дегранулирующих периваскулярных тучных клеток, можно считать одним из важных показателей ответной реакции микроциркуляторного русла. Именно здесь, по-видимому, осуществляются свойства NO поддерживать капиллярную вазодилатацию и подавлять аггрегацию тромбоцитов, обеспечивая тем самым нормальную реологию крови [9,16]. В свете полученных данных можно заключить, что высокая активность NOS в покровном эпителии крипт является одним из важных факторов, обеспечивающих не только местную антимикробную защитную функцию небных миндалин в ответ на микробную инвазию, но и механизмы становления гуморальных и клеточных иммунных реакций. Интересными с этой точки зрения являются результаты исследований Thomas G. Brock et al., доказывающих роль лейкотриенов в процессах активации лимфоцитов и синтеза иммуноглобулинов в мукозоассоциированной лимфоидной ткани, в частности в небных миндалинах [18]. Они показали, что эпителий крипт миндалин аналогичным образом является уникальным и неожиданным источником образования лейкотриенов, принимая участие в процессах активации лимфоцитов и синтеза иммуноглобулинов. Принимая во внимание обнаруженный нами факт высокой активности NOS в эпителии крипт миндалин при хроническом тонзиллите, можно заключить, что небные миндалины являются уникальными не только своим своеобразным строением, но и являются источником синтеза NO как важного медиатора, участвующего в процессах становления местного иммунитета и антимикробной защиты организма.

Немаловажным и интересным, на наш взгляд, надо считать также факт выявления активности NOS со стороны микробов и их колоний, локализованных как в криптах, так и тканях миндалин. В миндалинах NOS-активные микробы нами обнаруживались не только в криптах, но и в толще ретикулярного эпителия и в межфолликулярной лимфоидной ткани. Эти данные, указывающие на наличие бактериальной NOS, согласуются с мнением Pant K. et al. [15]. Присутствие NOS-активных микроорганизмов в тканях небных миндалин при хроническом тонзиллите является морфологическим доказательством неоднозначности функций NO.

Рис. 1. Активность NOS ‎в эпителии крипт небных миндалин: а – ‎эпителий крипт; б – микробы НАДФН – диафоразная реакция. Увеличение x1000

Рис. 2. Микроциркуляторное русло в под‎эпителиальной ткани крипт. Кислая фосфатаза сосудов по С.А. Сисакяну.
Увеличение x100

Исходя из вышеизложенного можно считать, что NO, будучи мощным антимикробным агентом, одновременно является защитным фактором для бактерий, обладающих NOS активностью. Данный факт дополнительно подтверждает мнение о сложности патогенетических процессов развития хронического воспаления, механизмов инвазии и взаимодействия макро- и микроорганизмов на уровне небных миндалин при хроническом тонзиллите.

Отсутствие существенных межгрупповых возрастных различий в наших результатах, свидетельствует о роли NO, как одного из универсальных и неспецифических факторов, обеспечивающих целостность барьеров и местную иммунную защиту. Отличия выявляются лишь в картине гистоморфологических изменений миндалин, где у больных I возрастной группы больше констатируются признаки гиперплазии лимфоидного аппарата, а у II – склеротические изменения.

Полученные данные свидетельствуют о значительной роли NO в сложных патогенетических механизмах развития хронического воспаления в миндалинах при тонзиллярной болезни и могут служить основанием для более глубокого изучения его роли в процессах взаимоотношения макро- и микроорганизма при хроническом тонзиллите.

Литература

1. Арзамасцев А.П., Северина И.С., Григорьев Н.Б., Граник В.Г. Экзогенные доноры оксида азота и ингибиторы NO-синтаз. 2003, с. 88–95.
2. Быкова В.П., Антонова Н.А. Юнусов А.С. Архангельская И.И. Клинико-морфологический анализ аденоидных вегетаций у детей. Вестник оториноларингологии, 2000,5.
3. Быкова В.П. Современные аспекты проблемы тонзиллярной болезни, Российская ринология, 1996, 2-3.
4. Вартазарян Н.Д. Изменения небных миндалин и внутритканевые микробные очаги при хроническом тонзиллите. Архив патологии, 1981, 5, с. 10–15.
5. Clement B., Shultze-Mosgau M., Wohlers H., Jung F. Enzymology and Biochemistry. Eds. M. Feelish, R. Busse, S. Moncada, London, 1994.
6. Csaba Szabo, Hiroshi Ohshima DNA damage induced by peroxynitrite, Nitric oxide, vol. 1, issue 5, October 1997, p. 373-385.
7. Feldman P.L., Griffith O.W., Stuehr D.J. Chem. Eng. News, 1993, vol. 71, p. 26.
8. Griffith O.W., Stuehr D.J. Annual review of physiology, 1995, vol. 57, p. 707.
9. Harpers.: Nitric oxide, Biochemistry, 2000, p. 715-730.
10. Judith Haendeler, Ulrike Weiland, Andreas M. Zeiher, Stefanie Dimmeler. Inhibition of endogenous NOS potentiates ischaemia-reperfusion-induced myocardial apoptosis via a caspase-3 dependent pathway, Cardivascular research, vol. 45, 3, February 2000, p. 671-678.
11. Linda A. Traylor, Philip R. Mayeux Superoxide generation by renal proximal tubule nitric oxide synthase, Nitric oxide, vol. 1, 5, October 1997, p. 432-438.
12. Marletta M.A. Biol. Chem., 1993, vol. 268, p. 12231.
13. Monsuy D., Boucher J.L., Clement B. Biochimie, 1995, vol. 77, p. 661.
14. Mostafa S. Hassan, Mayia M. Mileva, Harry S.Dweck, Louis Rosenfeld. Nitric Oxide Products Degrade Chondroitin Sulfates. Neonatal research labotarory, New York Medical College, Westchester Medical Center, 1998.
15. Pant K., Bilwes A.M., Adak S., Stuehr D.J., Crane B.R. Structure of a nitric oxide synthase heme protein from Bacillus Subtillis, Biochemistry, 2002, 41, p. 11071.
16. Ramzi S. Cotran, Vinay K., Tucker C. Robbin’s Pathologic Basis of Disease, 1999.
17. Stefanie Dimmeler, Andreas M. Zeiher. Effects of redox-related congeners of NO on apoptosis and Caspase-3 activity, Nitric oxide, vol. 1, 4, August 1997, p. 282-293.
18. Thomas G. Brock, Marci M. Lesperance Leukotriene Synthesis by Epithelial Cells of Human Mucosa-Associated Lymphoid Tissue, The Internet Journal of Asthma, Allergy and Immunology, 2000. vol.2, 1.
19. Vincent S.R., Kimura H. McGeer E.G. J. Neuroscience, Methods 9, p. 229-234.

Вопросы, ответы, комментарии